β淀粉酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

淀粉酶负责水解淀粉，主要包括 α-淀粉酶和 β-淀粉酶。β-淀粉酶(EC 3.2.1.2)可随机地作用于 淀粉中的 α-1,4-糖苷键，生成葡萄糖、麦芽糖、麦芽三糖、糊精等还原糖。

测定原理：

还原糖还原 3,5-二硝基水杨酸生成棕红色物质。α-淀粉酶不耐酸，β-淀粉酶不耐热。根据上 述特性，钝化其中之一，就可测出另一种淀粉酶的活力。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶  

试剂组成和配制：

试剂一：30mL×1 瓶，常温保存，若有黄色晶体析出，需 90℃加热溶解后再用； 试剂二：15mL×1 瓶，4℃保存，若出现沉淀析出，需 70℃加热溶解后再用。

酶液提取：
组织：称取 0.1~0.2g 样本（建议称取约 0.1g 样本），加入 1mL 蒸馏水，研磨匀浆；将匀浆 倒入离心管中，提取液在室温下放置提取 15min，每 5min 振荡 1 次，使其充分提取；3000g， 25℃离心 10min，取上清液加蒸馏水定容至 10 mL，摇匀，即淀粉酶原液。 吸取上述淀粉酶原液 1mL，加入 4mL 蒸馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀 粉酶总活力的测定。 血清（浆）等液体样本：（1）直接检测 α-淀粉酶。（2）吸取淀粉酶原液 1mL，加入 4mL 蒸 馏水，摇匀，即为淀粉酶稀释液，用于（α＋β）淀粉酶总活力的测定。
测定操作：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长到 540 nm，蒸馏水调零。 2、试剂一和试剂二 40℃预热 10min. 3、测定操作表： 试剂名称（μL） α-淀粉酶活力测定 总淀粉酶活力测定 对照管 测定管 对照管 测定管 淀粉酶原液 75 75 70℃水浴 15min 左右，冷却 淀粉酶稀释液 75 75 蒸馏水 75 75 试剂二 75 75 40℃恒温水浴中准确保温 5min 试剂一 150 150 150 150 混匀，95 度水浴 5min，冷却，取 200μL 至微量石英比色皿或 96 孔板中，540nm 处读取吸 光值，从左到右分别记为 A1、A2、A3 和 A4。每个测定管需设一个对照管。
计算公式：
酶活性计算： a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归曲线为 y=3.7215x -0.1778； x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。 2、α-淀粉酶活性（1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/g 鲜重)=[(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =1.075×(A2-A1＋0.1778)÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mg prot)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷（V 样×Cpr）÷T =0.1075×(A2-A1＋0.1778) ÷Cpr （3）血清（浆）等液体样本中 α-淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性(mg/min/mL)= [(A2-A1＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷V 样÷T=0.1075×(A2-A1＋ 0.1778) 3、总淀粉酶活性计算 （1）按照样品质量计算 单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 总淀粉酶活性(mg/min//g 鲜重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷(W×V 样÷V 样 总)÷T=5.375×(A4-A3＋0.1778)÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷（V 样×Cpr）÷T =0.5375×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr （3）血清（浆）等液体样本中总淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 总淀粉酶活性(mg/min/mL) =5×[(A4-A3＋0.1778)÷3.7215×V 反总]÷V 样÷T =0.5375×(A4-A3＋0.1778) 4、β-淀粉酶活性计算 （1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 β- 淀 粉 酶 活 性 (mg/min/g 鲜 重 )= 淀 粉 酶 总 活 性 -α- 淀 粉 酶 活 性 =[5.375×(A4-A3 ＋ 0.1778)-1.075×(A2-A1＋0.1778)]÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 β- 淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=淀粉酶总活性-α- 淀粉酶活性=[0.5375×(A4-A3＋ 0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr （3）血清（浆）等液体样本中 β-淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 β- 淀 粉 酶 活 性 （ mg/min/mL ） = 淀 粉 酶 总 活 性 -α- 淀 粉 酶 活 性 =0.5375×(A4-A3 ＋ 0.1778)-0.1075×(A2-A1＋0.1778) 5：总淀粉酶稀释倍数；V 反总：反应体系总体积，0.15mL；V 样：加入反应体系中样本体 积，0.075 mL；V 样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样 本质量，g；T：反应时间，5min。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归曲线为 y=2.481x -0.1778； x 为标准品浓度（mg/mL），y 为吸光值。 2、α-淀粉酶活性（1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 α- 淀 粉 酶 活 性 (mg/min/g 鲜 重 )=[(ΔA ＋ 0.1778)÷2.481×V 反 总 ]÷(W×V 样 ÷V 样 总)÷T=1.612×(ΔA＋0.1778)÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性（mg/min/mg prot）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷（V 样×Cpr）÷T =0.1612 ×(ΔA＋0.1778) ÷Cpr （3）血清（浆）等液体样本中 α-淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 α-淀粉酶活性（mg/min/mL）=[(ΔA＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷V 样÷T =0.1612×(ΔA＋0.1778) 3、总淀粉酶活性计算 （1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 总淀粉酶活性(mg/min/g 鲜重)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷(W×V 样÷V 样总)÷T =8.06×(ΔA＋0.1778)÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 总淀粉酶活性(mg/min/mg prot)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷（V 样×Cpr）÷T =0.806×(A4-A3＋0.1778) ÷Cpr （3）血清（浆）等液体样本中总淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 总淀粉酶活性(mg/min/mL)=5×[(A4-A3＋0.1778)÷2.481×V 反总]÷V 样÷T =0.806×(A4-A3＋0.1778) 4、β-淀粉酶活性计算 （1）按照样本质量计算 单位定义：每 g 组织在反应体系中每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 β- 淀 粉 酶 活 性 (mg/min/g 鲜 重 )= 淀 粉 酶 总 活 性 -α- 淀 粉 酶 活 性 =[8.06×(A4-A3 ＋ 0.1778)-1.612×(A2-A1＋0.1778)]÷W （2）按照蛋白质含量计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活力单位。 β- 淀 粉 酶 活性 （ mg/min/mg prot ） = 淀 粉 酶 总 活性 -α- 淀 粉 酶活 性 =[0.806×(A4-A3 ＋ 0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778)]÷Cpr （3）血清（浆）等液体样本中 β-淀粉酶活性计算 单位定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1mg 还原糖定义为 1 个酶活性单位。 β- 淀 粉 酶 活 性 （ mg/min/mL ） = 淀 粉 酶 总 活 性 -α- 淀 粉 酶 活 性 =0.806×(A4-A3 ＋ 0.1778)-0.1612×(A2-A1＋0.1778) 5：总淀粉酶稀释倍数；V 反总：反应体系总体积，0.15mL；V 样：加入反应体系中样本体 积，0.075 mL；V 样总：提取液总体积，10 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样 本质量，g；T：反应时间，5min。
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