γ谷氨酰转肽酶(γGT)测定测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

γ-GT 是γ-谷氨酰循环中的关键酶，催化 GSH 降解。γ-GT 催化 GSH 或者其他γ-谷氨酰基化合物上的γ-谷氨酰基转移到受体。也可以催化 GSH 和其他γ-谷氨酰基化合物的水解，产生谷氨酸盐，在细胞外谷胱甘肽中起了重要的作用。
测定原理：

γ-GT 催化谷氨酰对硝基苯胺中γ-谷氨酰基转移给 N-甘氨酰甘氨酸，生成对硝基苯胺，在405nm 有特征光吸收；通过测定 405nm 光吸收增加速率，来计算γ-GT 酶活性。自备仪器和用品:低温离心机、水浴锅、可调节移液器、酶标仪、96 孔板、蒸馏水
试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 25mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存。
酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 15min，取上清，置冰上待测。2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10

4个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3 秒，间隔7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 15min，取上清置于冰上待测。3. 血清等液体：直接测定。
测定操作：
1. 酶标仪预热 30min，调节波长到 405 nm。

2. 工作液配制：临用前将试剂三转移至试剂二瓶内，充分震荡溶解。如有少量未溶解的沉淀，取上层清液使用。用不完的试剂-20℃保存。

3. 在 96 孔板中依次加入 20μL 上清液，180μL 工作液，立即混匀后于37℃测定405nm下3min 和 13min 时吸光度，记为 A1 和 A2。ΔA=A2-A1.
计算公式：
γ-GT 活性计算：
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃时每毫克蛋白每分钟催化产生 1nmol 对硝基苯胺为1 个酶活单位。γ-GT（nmol/min /mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10
9]÷ (V 样×Cpr) ÷T=411.5×ΔA÷Cpr = 202.6×ΔA÷Cpr
(2). 按样本质量计算
活性单位定义：37℃时每克样本每分钟催化产生 1nmol 对硝基苯胺为1 个酶活单位。γ-GT（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10
9]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T
=202.6×ΔA÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃时每 10
4个细胞每分钟催化产生 1nmol 对硝基苯胺为1 个酶活单位。γ-GT（nmol/min/10
4 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10
9]÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T
=202.6×ΔA÷细胞数量
（4）按液体体积计算
活性单位定义：37℃时每毫升液体每分钟催化产生 1nmol 对硝基苯胺为1 个酶活单位。γ-GT（nmol/min/mL）= [ΔA×V 反总÷（ε×d）×10
9]÷V 样÷T
= 202.6×ΔA
V 反总：反应体系总体积，2×10
-4 L；ε：对硝基苯胺摩尔消光系数，9.87×10
3 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。注意事项：
1. 培养细胞中γ-GT 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中γ-GT 的提取时可加试剂一后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞（防止因为蛋白质变性导致酶失活）。
2. 配置好的工作液 2 周内使用完毕。

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