γ谷氨酰半胱氨酸连接酶(GCL)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

GCL 是 GSH 合成的限速酶，GSH 对 GCL 有反馈。GCL 基因表达受多种因素调节，如氧化剂、抗氧化剂、生长因子和因子等。GCL 活性高低对GSH 含量和GSH/GSSG比值有重要影响。
测定原理：

在 ATP 和 Mg2+存在下，GCL 催化谷氨酸和半胱氨酸合成γ-谷氨酰半胱氨酸；同时ATP去磷酸化产生无机磷分子，通过测定无机磷增加速率，即可计算出 GCL 活性。自备仪器和用品:冷冻离心机、水浴锅、移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、浓硫酸和蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：液体 105mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 6 mL 蒸馏水充分震荡溶解。试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加入蒸馏水 1.5 mL 充分震荡溶解。试剂四：液体 7mL×1 瓶，室温保存。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 12 mL 蒸馏水，充分震荡溶解后，缓缓加入400μL浓硫酸（自备），边加边搅拌。
酶液提取：
1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声3 秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。3. 血清等液体：直接测定。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 660nm，蒸馏水调零。2. 测定管：取 1.5mLEp 管，依次加入试剂一 48μL、试剂二 52μL、试剂三12μL 和上清液24μL，混匀后盖紧，37℃水浴准确反应 15 min；再加入试剂四 60μL，混匀后，室温（25℃左右）8000g，离心 10 min，取上清 100μL，加入试剂五 100μL，混匀后盖紧，45℃水浴10min，冷却后测定 660nm 处光吸收，记为 A 测定管。
计算公式：
GCL 活性计算公式：
标准曲线：y=0.1427x，R2=0.9987
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /mg prot）=(A 测定管÷0.1427×V 反总)÷(Cpr×V 样)÷T
=3.815×A 测定管÷Cpr
（2）按样本质量计算活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /g 鲜重）= (A 测定管÷0.1427×V 反总）÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 3.815×A 测定管÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每 104 个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的GCL 酶活量为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /104 cell）=(A 测定管÷ 0.1427×V 反总)÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
= 3.815×A 测定管÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /mL）= (A 测定管÷ 0.1427×V 反总)÷V 样÷T
= 3.815×A 测定管
0.1427：回归方程系数；V 反总：反应总体积（mL）196 μL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； V 样：加入反应体系中上清液体积，24μL =2.4×10-2 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；W：样本质量，g；T：反应时间：15min。
b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.07135x，R
2=0.9987
（(1). 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃下，每毫克蛋白每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /mg prot）=(A 测定管÷0.07135×V 反总)÷(Cpr×V 样)÷T
=7.63×A 测定管÷Cpr
（2）按样本质量计算
活性单位定义：37℃下，每克组织每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /g 鲜重）= (A 测定管÷0.07135×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 7.63×A 测定管÷W
（3）按细胞数量计算
活性单位定义：37℃下，每 104 个细胞每分钟催化产生 1μg 无机磷的GCL 酶活量为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /104 cell）=(A 测定管÷0.07135×V 反总)÷(细胞数量×V 样÷V 样总)÷T
= 7.63×A 测定管÷细胞数量
（4）按照液体体积计算
活性单位定义：37℃下，每毫升液体每分钟催化产生 1μg 无机磷的 GCL 酶活量为1 个酶活单位。
GCL（μg/min /mL）= (A 测定管÷0.07135×V 反总)÷V 样÷T
=7.63×A 测定管
0.07135：回归方程系数；V 反总：反应总体积（mL）196 μL=0.196 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL； V 样：加入反应体系中上清液体积，24μL =2.4×10-2 mL；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间：15min。
注意事项：（1）样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，以免影响其活力。如果是匀浆液，避免反复冻融。
（2）所有试剂配制完后，除表明 4℃保存外，请于 1 天内用完。
（3）实验过程请带手套，试剂三中有强腐蚀性物质，注意不要溅到皮肤上或眼睛内。（4）测定吸光值时请于水浴后 10～40 分钟内测完。
（5）样本测定前先取 1-2 个样做预实验，如吸光值太高，应先用试剂一(或者生理盐水)稀释到适当倍数，使得吸光值在标准曲线范围内，哺乳动物组织和血液一般稀释3～5 倍。（6）试剂三配制过程中，可能会产生黑色固体，其不影响结果，注意吸取时不要将黑色固体吸入。
（7）细胞中 GCL 活性测定时，细胞数目须在 300 万-500 万之间，细胞中GCL 的提取时可加试剂一（或生理盐水）后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞；

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