Ca++Mg++ ——ATP酶测试盒可见分光光度法

商品属性：

测定意义：

Ca++ Mg++-ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中,可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机磷。

测定原理：

根据 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷,通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性高低。 需自备的仪器及用品: 可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液: 液体 50mL ×1 瓶,4℃保存。 试剂一:液体 10mL×1 瓶,4℃保存。 试剂二:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。 试剂三:液体 5ml×1 瓶,4℃保存。 试剂四:粉剂×3 支,-20℃保存。用时每支加 1mL 蒸馏水,现用现配;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。 试剂五:液体 5mL×1 瓶,4℃保存。 试剂六:粉剂×1 瓶,4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水, 4℃保存。 试剂七:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水,溶解后 4℃保存一周。 试剂八:粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水,溶解后 4℃保存一周。 试剂九:液体 25mL×1 瓶,室温保存。 试剂十:10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶,4℃保存。0.5μmol/mL 标准磷应用液配制:将试剂十 20 倍稀释,即取 0.1mL 试剂 水充分混匀。 定磷剂的配制:按 H2O: 试剂七:试剂八:试剂九=2:1:1:1 的比例配制,配好的定磷剂应为浅黄色。若无色则试剂失效,若是蓝色则 剂现用现配。 注意:配试剂 用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染。

样品酶液的制备: 
1、细菌、细胞或组织样品的制备: 细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离 清,置冰上待测。 组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃ 上清,置冰上待测。  2、血清(浆)样品:直接检测。 
测定操作：
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 660nm,蒸馏水调零。 2、酶促反应(在 EP 管中加入下列试剂) 注意事项: 1、由于每一个样都必须做对照,本试剂盒 50 管只能测 24 份 Ca++ Mg++-ATP 酶。 2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。避免磷污染是检测成败的关键。 3、空白管和标准管只要做一管。
计算公式：
1、血清(浆)Ca++ Mg++- ATPase 活力的计算: 定义:规定每小时每毫升血清(浆)中 Ca++ Mg++- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol /h/ mL)=[ C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷V 样÷T=7.5×(A 测定管 准管-A 空白管)组织中 Ca++ Mg++- ATPase 的计算: 2、组织、细菌或细胞中 Ca++ Mg++- ATPase 活力的计算: (1)按蛋白浓度计算: 定义:每小时每毫克组织蛋白中 Ca++ Mg++- ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h/mg)=[C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(V样×Cpr)÷T =7.5×(A 测 管)÷(A 标准管-A 空白管)÷Cpr (2)按样本鲜重计算: 定义:每小时每克组织中 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h/g)= [C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(W× V 样÷V 样总)÷T=7.5×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷W (3)按细菌或细胞密度计算: 定义:规定每小时每 1 万个细菌或细胞中 Ca++ Mg++-ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶活力单位。 Ca++ Mg++-ATP 酶活力(μmol/h /104)= [C 标准管×V 总]×(A 测定管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)÷(500×V 样÷V 样总)÷T= 管-A 对照管)÷(A 标准管-A 空白管)C 标准管:标准管浓度,0.5μmol/mL;V 总:酶促反应总体积,0.5mL;V 样:加入样本体积,0.2mL 取液体积,1mL;T:反应时间,1/6 小时;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本鲜重,g;500:细菌或细胞总数,500 万。 
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