Na+k+  ——ATP酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

Na+K + - ATP 酶广泛分布于植物、动物、微生物和细胞中，可催化 ATP 水解生成 ADP 和无机 磷。

测定原理：

Na+K + -ATP 酶分解 ATP 生成 ADP 及无机磷，通过测定无机磷的量来确定 ATP 酶活性。 需自备的仪器和用品: 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。  

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL ×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 6mL 蒸馏水充分混匀待用；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂三：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。 试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。用时加入 3mL 蒸馏水， 4℃保存。 试剂五：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。 试剂六：粉剂×1 瓶, 4℃保存。用时加入 25mL 蒸馏水，溶解后 4℃保存一周。 试剂七：液体 25mL×1 瓶，室温保存。 试剂八：10mmol/L 标准磷贮备液 10mL×1 瓶，4℃保存。 0.5μmol/mL 标准磷应用液配制：将试剂八 20 倍稀释，即取 0.1mL 试剂八加 1.9mL 蒸馏水 充分混匀。 定磷剂的配制：按 H2O: 试剂五:试剂六:试剂七=2:1:1:1 的比例配制，配好的定磷剂应为浅 黄色。若无色则试剂失效，若是蓝色则为磷污染，定磷剂现用现配。 注意：配试剂 用新的烧杯、玻棒和玻璃移液器，也可以用一次性塑料器皿，避免磷污染。 

样品酶液的制备：
1、细菌、细胞或组织样品的制备： 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、血清（浆）样品：直接检测。  
测定操作：
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 660nm，蒸馏水调零。 2、酶促反应（在 EP 管中加入下列试剂） 对照管 测定管 试剂一（μL） 65 45 试剂二（μL） 60 60 试剂三（μL） 20 样本 （μL） 100 混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）准确水浴 10min 试剂四（μL） 25 25 样本 （μL） 100 混匀，8000g，25℃离心 10min，取上清液 3、定磷（在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂） 空白管 标准管 对照管 测定管 0.5μmol/ml 标准磷应用液（μL） 20 上清液（μL） 20 20 蒸馏水（μL） 20 定磷试剂（μL） 200 200 200 200 混匀，室温放置 30min，在 660nm 处，记录各管吸光值。 注意： 1、由于每一个样都必须做对照，本试剂盒 100 管保证测 48 份 Na+K + -ATP 酶。 2、此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管要求严格无磷。 3、空白管和标准管只要做一管。
计算公式：
1、血清（浆）Na+K + - ATPase 活力的计算: 定义：每小时每毫升血清（浆）中 Na+K + - ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 酶活力单位。 Na+K + -ATP 酶活力（μmol/h/mL）=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷V 样÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管） 2、组织、细菌或细胞中 Na+K + - ATPase 活力的计算： （1）按蛋白浓度计算： 定义：每小时每毫克组织蛋白中 Na+K + - ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个酶 活力单位。 Na+K + -ATP 酶活力(μmol/h /mg prot)=[C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管 -A 空白管）÷（Cpr×V 样）÷T =7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 定义：每小时每克组织中Na+K + -ATP 酶分解ATP 产生1μmol无机磷的量为一个酶活力单位。 Na+K + -ATP 酶活力(μmol/h /g 鲜重)=[ C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管 -A 空白管）÷(W× V 样÷V 样总)÷T=7.5×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 定义：每小时每 1 万个细菌或细胞中 Na+K + -ATP 酶分解 ATP 产生 1μmol 无机磷的量为一个 酶活力单位。 Na+K + -ATP 酶活力(μmol/h /104 cell) =[ C 标准管×V 总]×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管 -A 空白管）÷(500×V 样÷V 样总)÷T=0.015×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管） C 标准管：标准管浓度，0.5μmol/mL；V 总：酶促反应总体积，0.25mL；V 样：加入样本体 积，0.1mL ；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，1/6 小时；Cpr：样本蛋白质 浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
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