辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP

+和NADPH含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP+)含量和 NADPH/NADP

+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP

+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH。NADPH 通过PMS 的递氢作用，使氧化型噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定NADPH含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+为 NADPH，从而检测 NADP+含量。自备仪器和用品:酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后4 ℃保存一周；试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；试剂四：粉剂×1 支，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀；溶解后4℃保存一周；试剂五：液体 3.6mL×1 支，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。

酶液提取：
1 血清（浆）中 NADP
+和 NADPH 的提取
NADP
+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2 组织中 NADP
+和 NADPH 的提取：
NADP
+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约0.1g 组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NADP
+和 NADPH 的提取：
NADP
+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10
4个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），60℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10
4个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），60℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。2、 临用前将试剂一、二、三和四按以下比例配成混合液，用多少配多少，配制后立即使用试剂名称(μL) 混合液
试剂一 80
试剂二 30
试剂三 30
试剂四 30
3、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：
试剂名称(μL) 对照管 测定管样本 20 20
混合液 170 170
试剂六 200
试剂五 30 30
充分震荡混匀，室温避光静置 20min
试剂六 200
充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：试剂七 400 400
混匀，取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下读取对照吸光值A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。 注意事项
1、反应过程中注意避光。
2、若 NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 测定中△A（A2-A1）≤0.0222，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入1mL提取液。3、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个NAD+或NADH.

计算公式：
NADP
+和 NADPH 含量的计算
（一）NADP
+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.0985x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为NADP+浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中 NADP
+含量计算
NADP
+含量(nmol/mL）=[ (△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 203×(△A-0.0144）2、组织、细菌或细胞中 NADP
+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADP
+
(nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1) ]÷(V1×Cpr)= 10.2×(△A -0.0144）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADP
+
(nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(W×V1÷V2)=20.3×(△A -0.0144）÷W(3)按细菌或细胞密度计算
NADP
+
(nmol/10
4 cell）=[(△A -0.0144）÷0.0985×V1)] ÷(500×V1÷V2)=0.04×(△A-0.0144）（二）NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.6198x + 0.0259，R
2 = 0.9977；其中y 为△A，x 为NADPH浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL）= [(△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V3×V1÷V2)= 32.3× (△A-0.0259）2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷0.6198×V1)] ÷(V1×Cpr)= 1.6× (△A -0.0259）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(W×V1÷V2)=3.2× (△A -0.0259）÷W(3)按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/10
4 cell）=[(△A -0.0259）÷0.6198×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.006× (△A-0.0259）V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注意： 检测限为 0.01nmol/mL 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

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