辅酶ⅠNAD(H)含量测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

辅酶ⅠNAD(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NAD+是糖酵解（EMP）和三羧酸循环（TCA）的主要氢受体，生成的 NADH 经呼吸电子链（ETC）传递把电子交给氧，在合成 ATP 的同时，形成大量的 ROS，同时 NADH 再生为 NAD+。糖、脂、蛋白质三大代谢物质分解中的氧化反应绝大部分通过这一体系完成。NAD(H)含量和NADH/NAD+比值的高低可用于评价糖酵解和 TCA 循环的强弱。较高的 NAD(H)及 NADH/NAD+比值说明细胞呼吸耗氧量较高，处于过氧化状态。此外，NADH/NAD+比值升高也可抑制糖酵解和TCA循环。另外，NAD+降解产物对细胞信号传导、代谢和基因表达等具有重要的调控作用。
测定原理：

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NAD+和 NADH，NADH 通过 PMS 的递氢作用，还原氧化型噻唑蓝（MTT）为甲瓒，在 570nm 下检测吸光值；而 NAD+可被乙醇脱氢酶还原为NADH，进一步采用 MTT 还原法检测。自备仪器和用品:酶标仪、台式离心机、移液器、96 孔板、研钵、冰和蒸馏水
试剂组成和配制：

酸性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

碱性提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 10 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 3 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 瓶，-20 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；试剂四：粉剂×1 瓶，4 ℃保存，用时加入 3mL 蒸馏水，混匀，用不完的试剂4℃保存一周；试剂五：液体 3.6mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；

试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存
酶液提取：
1 血清（浆）中 NAD+和 NADH 的提取
NAD
+的提取：按照血清（浆）体积（mL）：酸性提取液体积（mL）为1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 酸性提取液），60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADH 的提取：按照血清（浆）体积（mL）：碱性提取液体积（mL）为1：5~10 的比例（建议取约 0.1mL 血清（浆），加入 1mL 碱性提取液），60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
2 组织中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD
+的提取：按照组织质量（g）：酸性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约0.1g组织，加入 1mL 酸性提取液），冰浴研磨，60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADH 的提取：按照组织质量（g）：碱性提取液体积（mL）为 1：5~10 的比例（建议取约0.1g组织，加入 1mL 碱性提取液），冰浴研磨，60℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
3 细胞或细菌中 NAD+和 NADH 的提取：
NAD
+的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10
4个）：酸性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入1mL 酸性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），60℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取500μL 上清液，加入 500μL 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。NADH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（10
4个）：碱性提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入1mL 碱性提取液），超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次），60℃水浴5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取500μL 上清液，加入 500μL 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定操作：
1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。2、 临用前将试剂一、二、三和四按以下比例配成混合液，用多少配多少，配制后立即使用试剂名称(μL) 混合液
试剂一 80
试剂二 30
试剂三 30
试剂四 30
3、 加样表(在 1.5mL 棕色 EP 管中按下表依次加样）：
试剂名称(μL) 对照管 测定管样本 20 20
混合液 170 170
试剂六 200
试剂五 30 30
充分震荡混匀，室温避光静置 20min
试剂六 200
充分混匀，静置 5min 后，20000g，25℃离心 5min，弃上清，沉淀中加入：试剂七 400 400
混匀，取 200μL 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中，570nm 下读取对照吸光值A1 和测定管吸光值 A2，计算△A=A2-A1。 注意事项
1、反应过程中注意避光。
2、若 NAD+测定中△A（A2-A1）≤0.0302，NADH 测定中△A（A2-A1）≤0.0222，说明样本中辅酶含量较低，已低于检测限，可做如下调整：（1）将测定管避光静置时间20min延长到 60min；（2）在提取阶段增加取样量，即取 0.2g 样本或 0.2mL 样本加入1mL提取液。3、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 100 管保证测 48 个NAD+或NADH

计算公式：
NAD+和 NADH 含量的计算
（一） NAD
+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1475x + 0.0302，R2 = 0.9978；其中 y 为△A，x 为NAD+浓度nmol/mL
1、血清（浆）中 NAD
+含量计算
NAD
+含量(nmol/mL）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1) ]÷(V3×V1÷V2)=135.6×(△A -0.0302）2、组织、细菌或细胞中 NAD
+含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NAD+
(nmol/mg prot）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(V1×Cpr)= 6.8×(△A -0.0302）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NAD+
(nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(W×V1÷V2)= 13.6×(△A -0.0302）÷W(3)按细菌或细胞密度计算
NAD+
(nmol/10
4 cell）=[(△A -0.0302）÷0.1475×V1)]÷(500×V1÷V2)=0.027×(△A-0.0302）（二）NADH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0.1404x + 0.0222，R
2 = 0.9976；其中 y 为△A，x 为NADH浓度 nmol/mL
1、血清（浆）中 NADH 含量计算
NADH 含量(nmol/mL）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 142.5×(△A-0.0222）2、组织、细菌或细胞中 NADH 含量计算
(1)按样本蛋白浓度计算
NADH (nmol/mg prot）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.1×(△A -0.0222）÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
NADH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(W×V1÷V2)= 14.2×(△A -0.0222）÷W(3)按细菌或细胞密度计算
NADH (nmol/10
4 cell）= [ (△A -0.0222）÷0.1404×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.028×(△A-0.0222）V1：加入反应体系中样本体积，0.02mL；V2：加入提取液体积，2mL；V3：加入血清（浆）体积：0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL； W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注意： 检测限为 0.1nmol/mL 或 0.1nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot

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