柠檬酸(CA)含量测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

CA 是生物体内常见的有机酸，是重要的食品风味物质。此外，CA 是三羧酸循环 步反 应的产物。
测定原理：

酸性条件下，柠檬酸还原 Cr6+生成 Cr3+，在 545nm 处有特征吸收峰；通过测定 545nm 吸光 值的增加，即可计算出样品中柠檬酸含量。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板和 蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体×1 管，－20℃保存。 试剂四：粉剂×1 瓶，室温保存。临用前配制，加入 2.5mL 试剂一，充分溶解。 试剂五：液体×1 瓶，4℃避光保存。 标准品：液体×1 管，250μmol/L 柠檬酸标准液，4℃保存。
样品中柠檬酸提取：
1. 液体样品中柠檬酸提取：取 0.1mL 液体加试剂一 0.9mL，充分混匀，11000g， 4℃离心 10min，取上清液，待测。 2. 组织中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取 约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。11000g，4℃离心 10min，取上清置冰 上待测。 3. 线粒体中柠檬酸提取：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称 取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆，600g/min，4℃离心 5min；取上清至 另一 EP 管中，11000g，4℃离心 10min，弃上清（此上清液可用于细胞质 CA 含量测定）； 向沉淀中加试剂二 200μl，以及试剂三 2μl，充分悬浮溶解，11000g，4℃离心 10min， 取上清液，待测。 4. 细菌、真菌中：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；11000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 545 nm，蒸馏水调零。 2. 试剂一置于 30℃水浴中预热 30min。 3. 空白管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μL 蒸馏水，140μL 试剂一，20μL 试剂四，20μL 试剂五，混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为 A 空白管。 4. 标准管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μL 标准液，140μL 试剂一，20μL 试剂四，20μL 试剂五，混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为 A 标准管。 5. 测定管：取 0.5 mL EP 管，依次加入 20μL 上清液，140μL 试剂一，20μL 试剂四，20μL 试剂五，充分混匀后室温静置 30min，于 545nm 测定吸光度，记为 A 测定管。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1. 按液体样品的体积计算 柠檬酸含量（nmol/mL）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×样品 稀释倍数×V 总 = 2500×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；样品稀释倍数：（0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一）÷ 0.1 mL 样品=10；V 总：1mL。 2. 按组织质量计算 柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷W = 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；W：样品质量， g。 3. 按蛋白含量计算 柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]÷Cpr = 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷Cpr C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。 4. 按细胞数量计算 柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷细胞数量 = 250×(A 测定管－A 空白管) ÷(A 标准管－A 空白管) ÷细胞数量 C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L； b.使用 96 孔板测定的计算公式如下 3. 按液体样品的体积计算 柠檬酸含量（nmol/mL）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×样品 稀释倍数×V 总 = 2500×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；样品稀释倍数：（0.1 mL 样品+0.9mL 试剂一）÷ 0.1 mL 样品=10；V 总：1mL。 4. 按组织质量计算 柠檬酸含量（nmol/g 鲜重）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷W = 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷W C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L；W：样品质量， g。 5. 按蛋白含量计算 柠檬酸含量（nmol/mg prot）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]÷Cpr = 250×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管) ÷Cpr C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；Cpr：上清液蛋白质含量，mg/mL。 6. 按细胞数量计算柠檬酸含量（nmol/104 cell）= [C 标准液×(A 测定管－A 空白管)÷(A 标准管－A 空白管)]×V 总÷细胞数量 = 250×(A 测定管－A 空白管) ÷(A 标准管－A 空白管) ÷细胞数量 C 标准液：250μmol/L=250 nmol/mL；V 总：上清液总体积，1.0 mL=0.001 L； 注意事项： 1. 样品处理等过程均需要在冰上进行。 2. 试剂四需现配现用，配置好的一周内使用完； 3. 试剂五为易，实验过程中，需佩戴手套，避免试剂五溅到皮肤上。 4. 柠檬酸提取液不能用于蛋白含量测定，如需测定蛋白含量，需另取组织，使用本公司 BCA 试剂盒进行测定。
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