红霉素N脱甲基酶(ERND)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

?胞色素 P450 酶是一组?要存在于肝脏的酶系?在外源物质代谢中?尤?是药物和毒物的 代谢??有重要作用?ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B ?型?与药物代谢的去甲基化 密?相关?CYP2B ?有催化?物形成非活性易于排泄的代谢产物而?有作用?也可使 某?药物? CYP2B 代谢活化?

测定原理：

ERND 催化红霉素释放甲醛?通过 Nash 比色测定甲醛含???可?算出 ERND 活性? 自备仪器和用品： 普通离心机?超速离心机?可调式移液枪?可见?光光度?/酶标仪?微?石英比色皿/96 孔 板?蒸馏水和冰?
试剂组成和配制：

试剂一?粉剂核1 瓶?4℃保存?临用前加 100mL 蒸馏水溶解? 试剂二?液体核1 瓶?4℃保存? 试剂й?粉剂核1 管?4℃保存?临用前加 1mL 蒸馏水?充?溶解? 试剂四?粉剂核1 瓶?4℃保存?临用前加 0.5mL 蒸馏水?充?溶解? 试剂五?粉剂核1 瓶?4℃保存?临用前?加蒸馏水 4.5mL 充?溶解? 试剂??液体核1 瓶?4℃保存? 试剂七?液体核1 瓶?4℃保存? 标准液?液体核1 瓶?-20℃保存?临用前取 1.5mL EP 管?加入 10μl 标准液?加 990μl 蒸馏 水?混匀?? 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液?4℃保存?
酶液提取：
1?除去?胞??线粒体等大?子物质??约 0.5g 组??加入 1mL 试剂一?冰к充?研磨? 10 000g 4℃离心 30min?取к清液?转入超速离心管中? 2?粗制微粒体?100 000g?4℃?离心 60min??к清液? 3?除血红蛋白等杂质?向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一?盖紧后充?震荡溶解?100 000g 离心 30min??к清液? 4?最?微粒体?向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL?充?震荡溶解??粗酶液?待测?该 待测液需当天使用?
测定操作：
1. ?光光度?/酶标仪预热 30 min?调节波长到 412 nm?蒸馏水调零? 2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min? 3. 对照管?取 0.5mL EP 管?加入 10μL 粗酶液?170μL 试剂二?10μL 试剂й?10μL 蒸馏 水?混匀后置于 37℃水浴保温 30min?立?加入 35μL 试剂五?混匀后置于冰浴中 5min?取 出后加入 35μL 试剂??混匀后室温静置 5min?室温 8000rpm 离心 5min?取新的 EP 管?加 入 100μL к清液?100μL 试剂七?混匀后 60℃水浴 10min?然后取出?用冷水冷? 5min? 于 412nm 测定光吸收?记? A 对照管? 4. 测定管?取 0.5mL EP 管?加入 10μL 粗酶液?170μL 试剂二?10μL 试剂й?10μL 试剂 四?混匀后置于 37℃水浴保温 30min?立?加入 35μL 试剂五?混匀后置于冰浴中 5min?取 出后加入 35μL 试剂??混匀后室温静置 5min?室温 8000rpm 离心 5min?取新 EP 管?加入100μL к清液?100μL 试剂七?混匀后 60℃水浴 10min?然后取出?用冷水冷? 5min?于 412nm 测定光吸收?记? A 测定管? 5. 标准管?取 0.5mL EP 管?加入 100μL 标准品?100μL 试剂七?混匀后 60℃水浴 10min? 然后取出?用冷水冷? 5min?于 412nm 测定光吸收?记? A 标准管? 注意??个?品都需要做对照管?
计算公式：
a.使用微?石英比色皿测定的?算?式如л (1). 按照蛋白浓度?算: 活性单位定义?37℃л???钟?毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛? 1 个酶活单位? ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管× 稀释倍数÷?Cpr×V ??÷T = 45×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管÷Cpr? (2). 按照?本质??算: 活性单位定义?37℃л???钟?克?品催化产生 1nmol 甲醛? 1 个酶活单位? ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管× 稀释倍数÷?W×V ??÷T = 45×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管÷W C 标准品?0.05 mmol/L=50μmol/L?V 标准品?100μL=1核10-4 L?稀释倍数?V 反总÷V к 清液=?50+850 +50+50+175+175?÷500=2.7?Cpr?粗酶液蛋白质浓度?mg/mL??需要另 外测定?建议使用本?司 BCA 蛋白质含?测定试剂盒?W??品质??g?V ??加入粗酶 液体??10μL=0.01mL?T?催化反?时间?min??30min? b.使用 96 孔板测定的?算?式如л (1). 按照蛋白浓度?算: 活性单位定义?37℃л???钟?毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛? 1 个酶活单位? ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管× 稀释倍数÷?Cpr×V ??÷T = 45×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管÷Cpr? (2). 按照?本质??算: 活性单位定义?37℃л???钟?克?品催化产生 1nmol 甲醛? 1 个酶活单位? ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管× 稀释倍数÷?W×V ??÷T = 45×?A 测定管ˉA 对照管?÷A 标准管÷W C 标准品?0.05 mmol/L=50μmol/L?V 标准品?100μL=1核10-4 L?稀释倍数?V 反总÷V к 清液=?50+850 +50+50+175+175?÷500=2.7?Cpr?粗酶液蛋白质浓度?mg/mL??需要另 外测定?建议使用本?司 BCA 蛋白质含?测定试剂盒?W??品质??g?V ??加入粗酶 液体??10μL=0.01mL? T?催化反?时间?min??30min?
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