葡萄糖脱氢酶(GCDH)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

GCDH（EC 1.1.1.47）催化D-葡萄糖和NAD(P)生成D-葡萄糖酸和NAD(P)H，大量存在于高 等动物的肝脏和弱氧化醋杆菌中。在低聚果糖生产中使用GCDH，不仅能去除低聚果糖中的 葡萄糖提高低聚果糖的含量，而且生成的葡萄糖酸与钙离子结合生成的葡萄糖酸钙是一种理 想的补钙制剂。因而，GCDH已成为制备高含量低聚果糖的理想用酶。
测定原理：

GCDH 催化 D-葡萄糖和 NAD 生成 D-葡萄糖酸和 NADH，在 340nm 下测定 NADH 上升速 率，即可反映 GCDH 活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰 和蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 19 mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；
样本的前处理：
 组织的前处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 细菌或培养细胞的前处理：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞 数量（104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定操作：
 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零； 2、 工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂 4℃可保 存一周； 3、 将工作液置于 37℃预热 5 分钟。 4、 在 96 孔酶标板中加入 10μL 样本和 190μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处初始吸光 值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
计算公式：
 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下： （1）按样本蛋白浓度计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCDH（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=3215×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCDH（nmol/min /104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=6.43×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下： （1）按样本蛋白浓度计算 单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算 单位定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCDH（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=6430×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 GCDH（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=12.86×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.05cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细 胞总数，500 万。
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