海藻糖酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

THL（EC 3.2.1.28）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。海藻糖酶主要功能在于 生物体分解海藻糖生成葡萄糖而直接用于能量供应。 
测定原理：

THL 催化海藻糖产生葡萄糖，葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化成葡萄糖酸，并产生过氧化氢； 过氧化物酶催化过氧化氢氧化 4-氨基安替比林偶联酚，生成有色化合物，在 505 nm 有特征 吸收峰，以此反映 THL 活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸 馏水。 
试剂组成和配制：

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃保存； 试剂二：液体 10ml×1 瓶，4℃保存； 试剂三：液体 10ml×1 瓶，4℃保存；（若出现结冰现象，可 37℃水浴溶解后使用）
样品测定的准备：
 1、细菌或细胞的处理：收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3S，间隔 10S，重复 30 次）；8000g，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 2、组织的处理：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 3、血清（浆）的处理：按照血清（浆）体积（mL）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建 议取 0.1mL 血清（浆）加入 1mL 提取液），冰浴中匀浆。8000g ，4℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。 
测定操作：
 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 505nm，蒸馏水调零。 2、 调节水浴锅至 95 度。 3、 工作液的配制：使用前将试剂二和试剂三 1:1 等体积混合，用多少配多少。 4、加样表： 45℃水浴，准确反应 15min，95℃水浴 5 分钟终止反应，得混合液(若出现沉淀可 10000g 4℃离心 10min 后取上清)。 混合液 20 20工作液 180 180 混匀，置 37℃（哺乳动物）或 25'C（其它物种）保温 15min 后，于 505nm 波长处读取 吸光度。计算 ΔA=A 测定管-A 对照管。每个测定管需设一个对照管。
计算公式：
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.4858x - 0.0042，R2 = 0.9999；x 为标准品浓度（μmol/mL）， y 为吸光值。 2、按照蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000 =366× (ΔA+0.0042) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 =366×(ΔA+0.0042)÷W 4、按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 =0.732×(ΔA+0.0042) 5、按血清（浆）体积计算 单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.4858×V 反总÷(V 液 ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 =3660×(ΔA+0.0042) V 样：加入样本体积：0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体 积，0.08mL；V 液：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；T：反应时间，15min； b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1、标准条件下测定回归方程为 y = 0.2429x - 0.0042，R2 = 0.9999；x 为标准品浓度（μmol/mL）， y 为吸光值。 2、按照蛋白浓度计算 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/mg prot)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T×1000 =732× (ΔA+0.0042) ÷Cpr 3、按样本鲜重计算 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/g 鲜重)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 =732×(ΔA+0.0042)÷W 4、按细菌或细胞密度计算 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。 THL 活力(nmol/min/104 cell)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反总÷(500 ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 =1.464×(ΔA+0.0042) 5、按血清（浆）体积计算 单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟催化产生 1nmol 葡萄糖定义为一个酶活力单位。THL 活力(nmol/min/mL)=(ΔA+0.0042) ÷0.2429×V 反总÷(V 液 ×V 样÷V 样总) ÷T×1000 =7320×(ΔA+0.0042) V 样：加入样本体积：0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；V 反总：反应体系总体 积，0.08mL；V 液：加入血清（浆）体积，0.1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W： 样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；T：反应时间，15min 
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