还原型谷胱甘肽(GSH)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

GSH 是细胞内最主要的抗氧化巯基物质，在抗氧化、蛋白质巯基保护和氨基酸跨膜运输等 中具有重要作用。还原型与氧化型比值（GSH/GSSG）是细胞氧化还原状态的主要动态指标。 因此，测定细胞内 GSH 和 GSSG 含量以及 GSH/GSSG 比值，能够很好地反映细胞所处的氧 化还原状态。
测定原理：

DTNB 与 GSH 反应生成复合物，在 412nm 处有特征吸收峰；其吸光度与 GSH 含量成正比。 自备仪器和用品： 低温离心机、水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、 和蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 18mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃避光保存。
酶液提取：
 1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。8000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。 2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 8000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。 3. 血清等液体：直接测定。
测定操作：
 1. 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412 nm。 2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 10min。 3. 空白管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，依次加入 20μL 蒸馏水，140μL 试剂二，40μL 试 剂三，混匀静置 2min 后测定 412 nm 吸光度 A1。 4. 测定管：取微量玻璃比色皿或 96 孔板，依次加入 20μL 上清液，140μL 试剂二，40μL 试 剂三，混匀静置 2min 后测定 412 nm 吸光度 A2。 注意：空白管只需要测定一次。
计算公式：
 GSH 标准曲线公式：y=1.5 x（x 为 GSH 浓度，μ mol /mL；y 为吸光值） a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按蛋白浓度计算 GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷1.5×V 样÷（V 样×Cpr） =0.667×(A2－A1) ÷Cpr （2）按样本质量计算 GSH（μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷1.5×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=0.667×(A2－A1) ÷W （3）按细胞数量计算 GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷1.5×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=0.667×(A2－A1) ÷细 胞数量

（4）按液体体积计算 GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷1.5×V 样÷V 样 =0.667×(A2－A1) V 反总：反应总体积，0.2mL；V 样总：上清液总体积，1 mL；V 样：加入反应体系中上清 液体积，20μL=0.02 mL；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下 GSH 标准曲线公式：y=0.75x（x 为 GSH 浓度，μ mol /mL；y 为吸光值） （1）按蛋白浓度计算 GSH（μ mol/ mg prot）=(A2－A1) ÷0.75×V 样÷V 样÷Cpr =1.334×(A2－A1) ÷Cpr （2）按样本鲜重计算 GSH（μ mol/g 鲜重）=(A2－A1) ÷0.75×V 样÷(V 样÷V 样总×W)=1.334×(A2－A1) ÷W （3）按细胞数量计算 GSH（μ mol /104 cell）=(A2－A1) ÷0.75×V 样÷(V 样÷V 样总×细胞数量)=1.334×(A2－A1) ÷ 细胞数量 （4）按液体体积计算 GSH（μ mol/ mL）=(A2－A1) ÷0.75×V 反总÷V 样 =1.334×(A2－A1) V 样总：上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02 mL；Cpr： 上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。 注意事项： 1. 试剂一中含有蛋白质沉淀剂，因此上清液不能用于蛋白浓度测定。 2. 检出限为 0.011mmol/L。
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