可溶性酸性转化酶(SAI)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

蔗糖转化酶（Invertase，Ivr）催化蔗糖不可逆地分解为果糖和葡萄糖，是高等植物蔗糖 代谢关键酶之一。根据最适 pH，Ivr 分为酸性转化酶（AI）和中性转化酶（NI）两种类型。 AI 的最适 pH 为 3～5。AI 分为可溶性 AI(S-AI)和细胞壁不溶性 AI（B-AI）两种类型。 S-AI 主要存在于细胞液泡或自由空间中，最适 pH 为 4.5~5.0（酸性），通过降解液泡中蔗 糖，调节液泡中蔗糖的利用和果实内糖类的积累。
测定原理：

S-AI 催化蔗糖降解产生还原糖，进一步与 3,5－二硝基水杨酸反应，生成棕红色氨基化 合物，在 510nm 有特征光吸收，在一定范围内 510nm 光吸收增加速率与 S-AI 活性成正比。 自备用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存; 试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存; 试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 10mL 试剂一充分溶解备用；用不完的试剂 4℃ 保存; 试剂三：液体 15mL×1 瓶，4℃保存；
酶液提取：
 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定操作：
 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 510nm，蒸馏水调零。 2、样本测定，（在 EP 管中依次加入下列试剂）： 试剂名称（μL） 测定管 对照管 样本 50 50 试剂一 200 试剂二 200 混匀， 37℃准确水浴 30min 后，95℃水浴 10min（盖紧，以防水分散失），流水冷却后充分 混匀（以保证浓度不变） 试剂三 125 125 混匀，95℃水浴 10min（盖紧，以防止水分散失），流水冷却后充分混匀，取 200μL 至微量 石英比色皿或 96 孔板中， 510nm 处记录各管吸光值 A，如果吸光值大于 2，可以用蒸馏水 稀释后测定(计算公式中乘以相应稀释倍数)，ΔA=A 测定-A 对照。每个测定管需设一个对照 管。
计算公式：
 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0016x -0.001；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为吸光值。 （1）按蛋白浓度计算： 单位的定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 S-AI 活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷Cpr （2）按鲜重计算： 单位的定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 S-AI 活性（μg/min/g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0016×V1]÷(W×V1÷V2) ÷T=20.8×(ΔA +0.001) ÷W V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 标准条件下测定的回归方程为 y = 0.0008x -0.001；x 为标准品浓度（μg/mL），y 为吸光值。 （1）按蛋白浓度计算： 单位的定义：37℃每 mg 蛋白每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 S-AI 活性（μg/min/mg prot）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(V1×Cpr ) ÷T=41.6×(ΔA +0.001) ÷Cpr （2）按鲜重计算： 单位的定义：37℃每 g 组织每分钟产生 1μg 还原糖定义为一个酶活性单位。 S-AI 活性（μg/min/g 鲜重）＝[(ΔA +0.001) ÷0.0008×V1]÷(W ×V1÷V2)=41.6×(ΔA +0.001) ÷W V1：加入反应体系中样本体积，0.05mL；V2：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，30min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。
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