磷脂酶D(PLD)测试盒可见分光光度法

商品属性：

测定意义：

磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与细胞脂质代谢、信号传导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理：

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅，无水乙醇。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 102mL×瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。 试剂三：粉剂×1 支，-20℃避光保存。临用前加 1mL 无水乙醇充分溶解；用不完的试剂分装 后-20℃保存，禁止反复冻融。 试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃避光保存。 标准品：液体 1mL×1 支，4℃避光保存。
酶液提取：
 1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。 2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min， 弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。 3. 血清：直接测定。 
测定操作：
 空白管 标准管 测定管 试剂一（μL） 20 试剂二（μL） 30 30 30 标准品（μL） 20 样品（μL） 20 试剂三（μL） 10 10 10 充分混匀，30℃反应 30min，沸水浴 1min，打开盖子，自然冷却 2min。 试剂四（μL） 140 140 140 30℃反应 30min，于微量石英比色皿/96 孔板，空白管调零，测定 500nm 处吸光值，分别记 为 A 标准管和 A 测定管。
计算公式：
 a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLD 活性（nmol/min /mg prot）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷Cpr÷T= 0.017 × 标准管 测定管 A A ÷Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单 位。 PLD 活性（nmol/min /g 鲜重）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷W÷T = 0.017× 标准管 测定管 A A ÷W 3．按照细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLD 活性（nmol/min /104 cell）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷细胞数量÷T = 0.017× 标准管 测定管 A A ÷细胞 数量 4．按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLD 活性（nmol/min /mL）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷T=0.017× 标准管 测定管 A A C 标准：标准品浓度，500nmol/L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T： 反应时间，30min b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLD 活性（nmol/min /mg prot）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷Cpr÷T= 0.017 × 标准管 测定管 A A ÷Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单 位。 PLD 活性（nmol/min /g 鲜重）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷W÷T = 0.017× 标准管 测定管 A A ÷W 3．按照细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。 PLD 活性（nmol/min /104 cell）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷细胞数量÷T = 0.017× 标准管 测定管 A A ÷细胞 数量 4．按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLD 活性（nmol/min /mL）= 标准管 测定管 A A ×C 标准÷T=0.017× 标准管 测定管 A A C 标准：标准品浓度，500nmol/L；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T： 反应时间，30min 注意事项 1. 显色完成后，若有沉淀，于 8000rpm，25℃离心 5min 后取上清测定。 2. 吸光值不宜超过 1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。
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