产地 | 国产 |
品牌 | 谷研 |
货号 | GOY-SH248 |
用途 | 仅供科研实验 |
英文名称 | PLD |
包装规格 | 100管/96样 |
纯度 | % |
CAS编号 | |
别名 | 磷脂酶D(PLD)测试盒 |
分子式 | |
是否进口 | 否 |
磷脂酶D(PLD)测试盒微量法
商品属性:
检测方法 |
规格 |
货号 |
微量法 |
100管/96样 |
GOY-SH248 |
测定意义:
磷脂酶 D(EC3.1.4.4)即磷脂酰胆碱水解酶,是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类
酶的总称,广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中,具有参与细胞脂质代谢、信号传
导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。
测定原理:
磷脂酶 D 催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱,胆碱在胆碱氧化酶
催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢,过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将 4-氨基安替比林和
重蒸酚氧化成粉红色物质,在 500nm 处有特征吸收峰。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水
浴锅、无水乙醇。
试剂组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:液体 102mL×瓶,4℃避光保存。
试剂二:液体 3mL×1 瓶,4℃避光保存。
试剂三:粉剂×1 支,-20℃避光保存。临用前加 1mL 无水乙醇充分溶解;用不完的试剂分装
后-20℃保存,禁止反复冻融。
试剂四:液体 15mL×1 瓶,4℃避光保存。
标准品:液体 1mL×1 支,4℃避光保存。
酶液提取:
1. 组织:按照质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g,加入 1mL
提取液)加入提取液,冰浴匀浆后于 4℃,10000g 离心 5min,取全部上清于 4℃、100000g
离心 30min,弃上清,取沉淀溶于 1mL 试剂一。
2. 细胞:按照细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500
万细胞加入 1mL 提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,
总时间 3min);然后于 4℃,10000g 离心 5min,取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min,
弃上清,取沉淀溶于 1mL 试剂一。
3. 血清:直接测定。
测定操作:
空白管 标准管 测定管
试剂一(μL) 20
试剂二(μL) 30 30 30
标准品(μL) 20
样品(μL) 20
试剂三(μL) 10 10 10
充分混匀,30℃反应 30min,沸水浴 1min,打开盖子,自然冷却 2min。
试剂四(μL) 140 140 140
30℃反应 30min,于微量石英比色皿/96 孔板,空白管调零,测定 500nm 处吸光值,分别记
为 A 标准管和 A 测定管。
计算公式:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min /mg prot)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷Cpr÷T= 0.017 ×
标准管
测定管
A
A
÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单
位。
PLD 活性(nmol/min /g 鲜重)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷W÷T = 0.017×
标准管
测定管
A
A
÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每 104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min /104
cell)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷细胞数量÷T = 0.017×
标准管
测定管
A
A
÷细胞
数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min /mL)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷T=0.017×
标准管
测定管
A
A
C 标准:标准品浓度,500nmol/L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL;T:
反应时间,30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1.按照蛋白浓度计算
酶活性定义:每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min /mg prot)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷Cpr÷T= 0.017 ×
标准管
测定管
A
A
÷Cpr
2.按照样本质量计算
酶活性定义:每克组织每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单
位。
PLD 活性(nmol/min /g 鲜重)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷W÷T = 0.017×
标准管
测定管
A
A
÷W
3.按照细胞数量计算
酶活性定义:每 104个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力单位。
PLD 活性(nmol/min /104
cell)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷细胞数量÷T = 0.017×
标准管
测定管
A
A
÷细胞
数量
4.按照液体体积计算
酶活性定义:每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生 1nmol 胆碱所需的酶量为一个酶活力
单位。
PLD 活性(nmol/min /mL)= 标准管
测定管
A
A
×C 标准÷T=0.017×
标准管
测定管
A
A
C 标准:标准品浓度,500nmol/L;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g/mL;T:
反应时间,30min
注意事项
1. 显色完成后,若有沉淀,于 8000rpm,25℃离心 5min 后取上清测定。
2. 吸光值不宜超过 1,否则用试剂一将酶液进行稀释,并在计算公式中乘以稀释倍数。
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