磷脂酶A2(PLA2)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

磷脂酶 A2（EC3.1.1.4）是磷脂 sn-2 位脂酰基水解酶，广泛存在于动植物组织、细菌、细胞 核分泌物中，参与脂肪消化，精子成熟、细胞信号传递、脂质过氧化修复、宿主反应等生理 过程，在控制体内磷脂类物质平衡。
测定原理：

磷脂酶 A2 作用于 2-硫代十六酰乙基磷酸胆碱（HEPC）产生游离巯基，与 DTNB 反应生成 黄色物质，在 412nm 处有特征吸收峰。 自备实验用品及仪器 天平、超速冷冻离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：液体×5 瓶，-20℃避光保存。临用前根据用量每瓶加入 1.8mL 试剂二充分混匀；用 不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。
样品处理：
1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL 提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min，弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。 2. 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后于 4℃，10000g 离心 5min，取全部上清于 4℃、100000g 离心 30min， 弃上清，取沉淀溶于 1mL 试剂一。 3. 血清：直接测定。
测定操作：
对照管 测定管 样品（μL） 20 20 试剂二（μL） 180 试剂三（μL） 180 充分混匀，37℃反应 10min，于微量石英比色皿/96 孔板，蒸馏水调 零，测定 412nm 处吸光值，记为 A 对照管和
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（? ×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 73.53×△A÷Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力单 位。 PLA2 活性（nmol/min/g 鲜重）= △A÷（? ×d）×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T = 73.53×△A÷W 3. 细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLA2 活性（nmol/min/104 cell）= △A÷（? ×d）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T = 73.53×△A÷细胞数量 4 按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（? ×d）×V 反总÷V 样÷T = 73.53×△A ? ：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，1mL； V 样：反应体系中加入样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V 样总：加入提取液体积，1mL； T：反应时间，10min b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLA2 活性（nmol/min/mg prot）= △A÷（? ×d）×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T =147.06×△A÷Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克组织每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力单 位。 PLA2 活性（nmol/min/g 鲜重）= △A÷（? ×d）×V 反总÷（W×V 样÷V 样总）÷T = 147.06×△A÷W 3. 细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLA2 活性（nmol/min/104 cell）= △A÷（? ×d）×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T =147.06×△A÷细胞数量 4 按照液体体积计算 酶活性定义：每毫升血清每分钟水解 HEPC 产生 1nmol 游离巯基所需的酶量为一个酶活力 单位。 PLA2 活性（nmol/min/mL）= △A÷（? ×d）×V 反总÷V 样÷T = 147.06×△A ? ：TNB 消光系数，13600L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，1mL； V 样：反应体系中加入样本体积，0.1mL；W：样本质量，g；V 样总：加入提取液体积，1mL； T：反应时间，10min
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