抗坏血酸氧化酶(AAO)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

AAO 是定位于植物细胞壁的糖蛋白，属“蓝铜氧化酶”家族。细胞壁内的抗坏血酸和 AAO 与 细胞壁的代谢和生长有着密切的联系。AAO 氧化 AsA 所形成的 MDHA 可通过质膜上的 细胞色素 b 还原，该过程中电子的跨膜运输能够生长。
测定原理：

AAO 可直接氧化 AsA，通过测定 AsA 的氧化量，可计算得 AAO 活力。 实验中所需仪器及设备： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、可调式移液器、 研钵、冰、蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。 试剂三：粉剂×2 瓶，4℃避光保存。
酶液提取：
按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。16000g，4℃离心 10min，取上清置冰上待测。
测定操作：
1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 265 nm。 2. 试剂二在 25℃水浴锅中预热 30 min。 3. 取 1 瓶试剂三，加入 1mL 蒸馏水充分溶解；配好的试剂三 3 天内用完。 4. 工作液的配制：将试剂二与试剂三按 170(μL)：10(μL)的比例混合，用多少配多少。 5. 依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 上清液、180μL 工作液，迅速混匀后在 265nm 测定 10s 和 130s 光吸收 A1 和 A2，△A =A1-A2。
计算公式：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1). 按蛋白浓度计算 AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×109 ÷(Cpr×V 样)÷T = 92.4×△A÷Cpr (2). 按样本质量计算 AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 92.4×△A÷W ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm； V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106 ：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质 浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品 质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间（min），2min。 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下(1). 按蛋白浓度计算 AAO 活性单位定义：25℃中每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 AAO(nmol/min /mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(Cpr×V 样)÷T =184.8×△A÷Cpr (2). 按样本质量计算 AAO 活性单位定义：25℃中每克样本每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 AAO(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×109÷(W×V 样÷V 样总)÷T = 184.8×△A÷W ε：AsA 在 265nm 处摩尔吸光系数为 5.42×104 L/mol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5 cm； V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10-4 L；106 ：1mol=1×106μmol；Cpr：上清液蛋白质 浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品 质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02 mL；V 样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间（min），2min。
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