抗坏血酸过氧化物酶(APX)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

APX 是植物清除活性氧的重要抗氧化酶之一，也是抗坏血酸代谢的关键酶之一。APX 具有 多种同功酶，分别定位于叶绿体、胞质、线粒体、过氧化物和乙醛酸体，以及过氧化体和类 囊体膜上。APX 催化 H2O2 氧化 AsA，是植 AsA 的主要消耗者。APX 的活性直接影响到 AsA 的含量，APX 与 AsA 具有一定的负相关性。
测定原理：

APX 催化 H2O2氧化 AsA，通过测定 AsA 氧化速率，来计算得 APX 活性。 自备仪器用品： 低温离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板（UV 板）、移液枪、研钵、 冰和蒸馏水。
试剂组成和配制：

试剂一：液体 120mL×1 瓶，4℃保存。 试剂二：粉剂×2 支，4℃保存。临用前加 1.5 mL 蒸馏水充分溶解（溶解后 4℃保存，3 天内 用完）。 试剂三：液体 3mL×1 支，4℃保存。
酶液提取：
 按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。13000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。
测定操作：
 1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min 以上，调节波长到 290nm，用蒸馏水调零。 2. 试剂一在 25℃中预热 30min。 3.依次在微量石英比色皿/96 孔板中加入 20μL 上清液、140μL 预热的试剂一 20μL 试剂二和 20μL 试剂三，迅速混匀后在 290nm 测定 10s 和 130s 光吸收 A1 和 A2，△A=A1-A2。
计算公式：
 a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下 (1) 按样本蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10 9÷(Cpr×V 样)÷T =1786×△A÷ Cpr （2）按样本质量计算 活性单位定义：每 g 组织每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 APX(nmol/min/g 鲜重 ) = △A÷(ε×d）×V 反总×10 9÷(W×V 样÷V 样总)÷T =1786×△A ÷W ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×10 3 L/mol/cm；d：比色皿光径（cm），1 cm；V 反 总：反应体系总体积（L），200μL=2×10 -4 L；10 9：1mol=1×10 9nmol；Cpr：上清液蛋白质浓 度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品质 量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间（min），2min。 b.使用 96 孔板测定的计算公式如下(1) 按样本蛋白浓度计算 活性单位定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 APX(nmol/min/mg prot) = △A÷(ε×d）×V 反总×10 9÷(Cpr×V 样)÷T =3571×△A÷ Cpr （2）按样本质量计算 活性单位定义：每 g 组织每分钟氧化 1nmol AsA 为 1 个酶活单位。 APX(nmol/min/g 鲜重) = △A÷(ε×d）×V 反总×10 9÷(W×V 样÷V 样总)÷T =3571×△A ÷W ε：AsA 在 290nm 处摩尔吸光系数为 2.8×10 3 L/mol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5 cm；V 反总：反应体系总体积（L），200μL=2×10 -4 L；10 9：1mol=1×10 9nmol；Cpr：上清液蛋白质 浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W ：样品 质量；V 样：加入反应体系中上清液体积（mL），20μL=0.02mL；V 样总：提取液体积，1 mL； T：催化反应时间（min），2min。
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