肉毒碱棕榈酰转移酶(CPT1)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

肉毒碱棕榈酰转移酶是存在于线粒体内膜的一类酰基转移酶。可逆地催化从酰基辅酶 A 将 酰基转移至 L-肉毒碱的反应，在转运脂肪酸通过线粒体内膜的过程中起重要作用。 
测定原理：

基于肉碱和脂酰辅酶 A 在丙二酰辅酶 A 存在与否的条件下，通过肉碱脂酰转移酶(CPT-I)的 作用，产生脂酰肉碱，并释放出巯基辅酶 A(COA-SH)，与 Ellman 试剂 DN-TB 反应后，产 生黄色的 TNB。通过其吸收峰值得变化（412nm），来定量分析 CPT-1 的活性。 需自备的仪器和用品： 可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰、无水乙醇和蒸馏水
试剂组成和配制：

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂二：液体 20mL×1 瓶，-20℃保存； 试剂三：液体 1.5mL×1 支，-20℃保存； 试剂四：液体 30mL×1 瓶，4℃保存； 试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存； 试剂六：粉剂×1 支，-20℃保存；
样本的前处理：
 组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离： ① 称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂三，用冰浴匀浆器 或研钵匀浆。 ② 将匀浆液于 600g，4℃离心 5min。 ③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心 10min。 ④ 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的 CPT-1（此步可选做）。 ⑤ 在步骤④的沉淀中加入 200uL 试剂二和 2uL 试剂三，超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3 秒，间隔 10 秒，重复 30 次），用于线粒体 CPT-1 测定。
测定操作：
 1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 412nm，蒸馏水调零。 2、样本测定 （1）在试剂五中加入 1mL 无水乙醇，混匀，再加入 22mL 试剂四，混匀，37℃（哺乳动物） 或 25℃（其它物种）孵育 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； （2）在试剂六中加入 1mL 蒸馏水，混匀，37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）孵育 5min； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融； （3）在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、220μL 试剂五和 10μL 试剂六，混 匀，记录 412nm 处 20 秒时的初始吸光度 A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 ΔA=A2-A1。
计算公式：
 a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=880×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W× V 样÷V 样总）÷T=177.8×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.3556×ΔA V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：比 色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL；T： 反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总 数，500 万。 b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下： （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=1760×ΔA÷Cpr 此法需要自行测定样本蛋白质浓度。 （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（W ×V 样÷V 样总）÷T=355.6×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟催化产生 1 nmol TNB 定义为一个酶活力单位。 CPT-1（nmol/min/104 cell）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷（500×V 样÷V 样总）÷T=0.711×ΔA V 反总：反应体系总体积，2.4×10-4 L；ε：TNB 摩尔消光系数，1.36×104 L / mol /cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，0.202 mL； T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细胞或细 菌总数，500 万。
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