羟脯氨酸(HYP)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

HYP 是机体胶原蛋白主要成分之一，胶原蛋白大多分布于皮肤、腱、软骨等，因此 HYP 含量是反映胶原组织代谢及纤维化程度的一项重要指标。
测定原理：

样品经水解产生游离的 HYP，进一步被氯胺 T 氧化，氧化产物与对二甲氨基苯甲醛反应， 产生红色化合物，在 560nm 处有特征吸收峰。通过测定样品水解液 560nm 吸光值，可计算 HYP 含量。 自备实验用品及仪器： 天平、烘箱、玻璃管、离心机、水浴锅、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、 无水乙醇、异丙醇、6mol/L 盐酸和蒸馏水。
试剂组成和配制：

组织提取液：6mol/L 盐酸，自备。浓盐酸：H2O（V/V）= 1:1，室温保存。 细胞提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。 试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。
酶液提取：
1. 组织：称取约 0.2g 样品于玻璃管，加入 2mL 的组织提取液，置于 110℃烘箱，水解 6 至 12 小时，用提取液定容至 2mL，12000g，25℃，离心 20min，取上清待测。 2. 细胞：取约 500 万个细胞，加入 1mL 的细胞提取液，于高压消毒器中 15 磅保持 30min， 自然降压后待测。 3. 血清游离羟脯氨酸提取：取 0.1mL 血清，加入 0.5mL 无水乙醇使蛋白质沉淀，8000g4℃ 离心 5min。将上清倒入另一个 EP 管，氮吹或沸水浴将乙醇挥发干。冷却后再加入 0.2mL50%异丙醇，充分溶解混匀待测。
测定操作：
1、 分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 560nm，蒸馏水调零。 2、 操作表 对照管 测定管 样本（μL） 60 试剂一（μL） 60 60 混匀，室温静置 20min 试剂二（μL） 60 60 H2O（μL） 180 120 混匀，60℃，20min，取出后 25℃静置 15 min，取 200μL 于微量石英比色皿/96 孔板中检测 560nm 处吸光值。ΔA=A 测定-A 对照
计算公式：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下 标准曲线：y=64.875x+ 0.0251，R2=0.9991 （1）按样品重量计算 组织羟脯氨酸含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V 反总÷(V 样÷V 样总×W)= 0.154×（ΔA-0.0251）÷W （2）按细菌或细胞密度计算 细胞羟脯氨酸含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷64.875×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞数量（万 个）= 0.077×（ΔA-0.0251）÷ 细胞数量（万个） （3）按血清体积计算 HYP 含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷ 64.875×V 反总÷V 样×2 =0.154×（ΔA-0.0251） V 反总：反应总体积，0.3 mL；V 样：反应中样品体积，0.06mL；V 样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g b.用 96 孔板测定的计算公式如下 标准曲线：y=32.4375x+ 0.0251，R2=0.9991 （1）按样品重量计算 HYP 含量（mg/g 鲜重）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V 反总÷(V 样÷V 样总×W) = 0.308×（ΔA-0.0251）÷W （2）按细菌或细胞密度计算 HYP 含量（mg/104 cell）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V 反总÷V 样×V 样总÷细胞数量（万个） = 0.154×（ΔA-0.0251）÷细胞数量（万个） （3）按血清体积计算 HYP 含量（mg/mL）=（ΔA-0.0251）÷32.4375×V 反总÷V 样×2 = 0.308×（ΔA-0.0251） V 反总：反应总体积，0.3 mL；V 样：反应中样品体积，0.06mL；V 样总：加入提取液体积， mL；W：样本重量，g；2，血清吹干后复溶的倍数。 注意事项： 1、 吸光值大于 0.8，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。 2、 试剂有一定的毒性，请操作时做好防护措施，防止吸入或与皮肤接触。 3、 检出限为 3.8mg/L。
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