漆酶测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

漆酶（CE1.10.3.2）是一种含铜的多酚氧化酶，属于铜蓝氧化酶家族，广泛分布于真菌和高 等植物中，具有较强的氧化还原能力，在纸浆生物漂白，环境污染物降解和木质纤维素降解 以及生物检测方面有非常广泛的应用。 
测定原理：

漆酶分解底物 ABTS 产生 ABTS 自由基，在 420nm 处的吸光系数远大于底物 ABTS，测定 ABTS 自由基的增加速率，可计算得漆酶活性。 自备实验用品及仪器 天平、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。 试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存。 工作液：粉剂×1 瓶，4℃避光保存，临用前加 15mL 试剂一溶解；用不完的试剂 4℃保存一 周。 
酶液提取：
 1． 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。12000g 4℃离心 30min，取上清，置冰上待测。 2． 细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒， 总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置于冰上待测。 3． 细胞培养液：直接检测。 
测定操作：
 对照管 测定管 样本（μL） 45 45 试剂一（μL） 255 工作液（μL） 255 60℃水浴 20min 后冷却至室温，取 200μL 反应液于微量石英比色皿/96 孔 板中测定 420nm 处吸光值 A，△A=A 测定管-A 对照管 注意： 1、 极少数样本在 60℃水浴 20min 后会出现沉淀，可经过 8000g 25℃离心 10min 后，取上 清检测，例如成熟的水稻叶片样本。 2、 为确保检测准确性，若ΔA 大于 1，将样本用提取液稀释 2~10 倍后重新检测，计算公式 乘以相应稀释倍数。
计算公式：
 a．用微量石英比色皿测定的计算公式如下 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /mg prot）= d A ? ? ? ×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 9.26×△ A÷Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /g 鲜重）= d A ? ? ? ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 9.26×△ A÷W 3．按照细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /104 cell）= d A ? ? ? ×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T= 9.26×△ A÷ 细胞数量 4．按照液体体积计算 酶活性定义：每升培养液每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /L）= d A ? ? ? ×V 反总÷V 样÷T= 9260×△ A ε：ABTS 毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积， 0.3mL；V 样：反应体系中样本体积，0.03mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样 本蛋白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，20min b. 用 96 孔板测定的计算公式如下 1．按照蛋白浓度计算 酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /mg prot）= d A ? ? ? ×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 18.52×△ A÷Cpr 2．按照样本质量计算 酶活性定义：每克样品每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /g 鲜重）= d A ? ? ? ×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 18.52×△ A÷W 3．按照细胞数量计算 酶活性定义：每 104个细胞每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /104 cell）= d A ? ? ? ×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T = 18.52×△ A÷细胞数量 4．按照液体体积计算 酶活性定义：每升培养液每分钟氧化 1nmol 底物 ABTS 所需的酶量为一个酶活力单位。 漆酶活性（nmol/min /L）= d A ? ? ? ×V 反总÷V 样÷T= 18520×△ A ε：ABTS 毫摩尔消光系数：36L/mmol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积， 0.3mL；V 样：反应中样本体积，0.045mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋 白浓度，mg/mL；W，样本质量，g；T：反应时间，20min
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