肉桂酸4羟化酶(C4H)测试盒微量法

商品属性：

测定意义：

C4H 又称反式肉桂酸-4-单氧化酶，多存在于高等植物、酵母、菌类中，该酶催化肉桂酸羟 化作用产生 4-香豆酸盐，是苯丙烷途径中继 L-苯丙氨酸解氨酶之后的 个关键酶。 
测定原理：

C4H 催化肉桂酸和 NADP 生成 4-香豆酸盐和 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 生成速率， 即可反映 C4H 活性。 需自备的仪器和用品： 紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰 和蒸馏水。
试剂组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存； 试剂一：液体 25 mL×1 瓶， 4℃保存； 试剂二：粉剂×2 瓶，-20℃保存；
酶液提取：
 细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量 （104个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提 取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。 
测定操作：
 1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。 2、 样本测定 （1）取试剂二一瓶，加入 10mL 试剂一充分溶解混匀，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其 它物种）水浴 5min；现配现用（配好后 24h 内用完）； （2）在微量石英比色皿或96孔板中加入10μL样本和190μL试剂二，混匀，立即记录340nm 处初始吸光值 A1 和 5min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。
计算公式：
 a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下 （1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。 b.用 96 孔板测定的计算公式如下 1）按样本蛋白浓度计算： 单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr （2）按样本鲜重计算： 单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W （3）按细菌或细胞密度计算： 单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。 C4H（nmol/min/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109 ]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总 数，500 万。
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